老化是生命个体无法抵抗的自然过程，包括组织和器官结构的变性和功能的衰退。皮肤是身体最大的器官，皮肤衰老即皮肤老化是人们关注的问题。因此，如何延缓衰老，逆转皮肤老化，是近年来美容、抗衰老领域的研究热点之一。在一定条件下，干细胞是一类多能细胞，具有自我复制、特异分化为多种功能细胞的能力，具有很强的组织修复和再生能力。在抗衰研究领域，干细胞移植治疗取得了丰硕的成果，将干细胞植入体内，可以显著延缓衰老，但在组织内并没有发现已植入的干细胞，说明干细胞抗衰老的作用可以通过旁分泌来实现，而旁分泌的最重要结构是细胞外分泌。作为非细胞疗法的替代品，外泌体可以避免干细胞移植所带来的免疫排斥反应、干性维持、细胞衰老和致癌[2]等风险，有望成为抗衰老领域的一个新方向。本文综述了干细胞外泌体在抗皮肤老化方面的研究进展。

第一，外泌体的生物学特性。

加拿大科学家于1980年代在网织红细胞向红细胞成熟的过程中，发现了一种类似囊泡的纳米物质，并将其命名为外泌体[3]。在-20℃条件下能长期保存40~100nm的外泌体，并且反复冻融对其体积无明显影响。已有的分离方法有很多种，其中密度梯度离心法最为常用。用透射电子显微镜、纳米粒子追踪法或流式细胞仪等方法对分离出的外泌体颗粒进行生物学鉴定。在此基础上，研究发现，外泌体共表达CD9、CD63、CD81和CD82，并能特异地表达与其来源细胞相似的粘附分子，如间充质干细胞可表达CD29、CD44和CD73等。通过细胞与细胞之间的信号交换，外泌体参与机体一系列病理生理过程[4]。其主要内容物为蛋白质、RNA和脂质组分，外泌体RNA不能完全代表起源细胞RNA，只能有选择地含有部分RNA[5]，而血清RNA与组织内RNA并不严格匹配[6]。间充质干细胞外泌体[7]自2010年首次检测以来，已分离出多种干细胞来源的外泌体，其中脐带间充质干细胞[8]在2013年首次报告，比其他来源的干细胞外泌体富含更多生长因子[9]。在组织损伤修复、慢性伤口愈合、抑制伤口瘢痕形成和抗衰老等方面，干细胞外泌体的基础研究不断涌现[10-12]。

皮肤衰老的一种生理病理机制。

肌肤老化分为内外源老化，前者主要表现为皮肤干燥、细纹、胶原纤维及弹性纤维减少、皮下脂肪变薄，是人体随年龄增长逐渐出现的正常肌肤老化；后者主要表现为皮肤干燥、皱纹深陷、皮肤松弛弹性下降、粗糙、色素不均匀，多由环境因素所致，特别是紫外线所致。肌肤的老化可以反映整个身体的老化程度。表皮细胞增殖分裂能力下降，成纤维细胞功能异常，乳头层变平，细胞外基质成分和含量的变化，这些都是内外源性皮肤老化引起的病理生理变化。在这个过程中，涉及到的有细胞衰老、DNA损伤、基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)、活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)、激素(合成代谢激素，如性激素，生长激素，胰岛素样生长因子)等。抗氧化作用、调节MMPs活性和成纤维细胞功能等可能是皮肤抗衰老的有效途径。

干细胞外泌体可能的抗皮肤衰老机制。

外泌体对纤维母细胞功能的影响及其分子机制。

真皮层细胞中以成纤维细胞为主，能产生胶原蛋白和其它细胞外基质成分。成纤维细胞在机体内几乎不增殖，其功能损伤和细胞外基质的变化与外源性皮肤老化有密切关系[15]。外泌体-成纤维细胞主要在细胞核周围聚集[11]，可将miR21-3p转运至细胞内，并下调抑癌基因PTEN和SPRY1的表达，从而激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinases,PIY1)、蛋白丝氨酸苏氨酸激酶(protein-serine-threoninekinase,AKT)和细胞外信号调节激酶(extracellularsignal-regulatedkinase,ERK1/2)的信号通路，调节细胞功能，并且外泌体作用的强度随时间逐渐减弱[10]。成纤维细胞含有多种生长因子，如血小板型生长因子(platelet-derivedgrowthfactor,PDGF)，成纤维细胞可在其中表达PDGF受体[16],PDGF与相应受体结合后，可以激活丝裂原激活蛋白激酶信号通路(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)，促进细胞增殖。老化细胞对PDGF活性显著降低，上调AKT-1激酶表达量可使老化细胞恢复PDGF活性[17]。体外培养的间充质干细胞能够激活MAPK信号途径，从而促进细胞增殖[18]。外分泌体能增强成纤维细胞的增殖能力，具有浓度依赖性，并能逆转UVB诱导的成纤维细胞老化现象，但对内源性衰老因素引起的细胞老化效果不明显[20]。另外一项研究发现，与糖尿病创伤来源的HDF相比，外泌体促进人成纤维细胞(humandermalfibroblast,HDF)增殖的作用更强，但在细胞迁移试验中发现后者对外泌体更敏感[11]，这些都表明外泌体对成纤维细胞的作用有限。成纤维细胞的增殖和细胞外基质成分的再生能力降低，加速了组织结构的破坏，从而导致外源性衰老-皱纹的产生[21]。蛋白印迹法检测到正常的成纤维细胞AKT，信号转导和转录激活因子3(signaltransducersandactivatorsoftranscription,STAT3),ERK1/2表达有显著的增加，特别是STAT3，可以激活一系列基因的表达，包括细胞周期蛋白和生长因子(如肝细胞生长因子(Hepatocytegrowthfactor,HGF)，神经生长因子(nervegrowthfactor,NGF)，基质内的生长因子(stromal-derivedgrowthfactor-1,SDF1)，胰岛素样生长因子(insulin-likegrowthfactor-1,IGF1))等。PI3K/AKT和ERK1/2以及MAPK信号途径都是调节细胞在体内生长、增殖和分化的重要途径，ERK是MAPK家族的一员，它们之间存在着交联，构成了MAPK信号网络，MAPK在其中发挥着重要作用。体内外实验证明，系外泌体-内源性RNAs能促进伤口愈合，而非内源性蛋白[22]。外泌体含非编码长链RNA(MALAT1)，可促进成纤维细胞迁移和血管再生，MALAT1去除后，细胞迁移率下降[23]。

外分泌对MMPs的影响及其分子机制

金属蛋白酶是一种广泛存在于生物体中的多肽链内切酶，因其活性部位与金属离子结合而得名。其成员之一，包括24个亚型，其中23个存在于哺乳动物体内，可由成纤维细胞、内皮细胞等产生，主要负责细胞外基质的降解和胶原转化。MMP1,MMP3,MMP9在皮肤中占主导地位，它们几乎能降解真皮细胞外基质中的所有分子，特别是组成真皮结构的胶原纤维和弹性纤维，因此MMP可能是调节皮肤光老化的主要靶标[24-26]。1996年，Fisher等[27]首先进行了人体研究，发现UVB照射人体皮肤后，通过上调转录因子AP-1和NF-κB在角质形成细胞和成纤维细胞中的表达和激活，并且这种作用是剂量依赖的。结果表明，MMP在皮肤的内源性老化和外源性老化过程中均有表达，并呈增高趋势。对于未暴露部位皮肤，年长的患者比年轻的患者有更多的MMP[28]，而老化皮肤中金属蛋白酶内源性抑制剂(tissueinhibitorsofmetallopro-teinases,TIMPs)相对较少[29],TIMPs通过非共价键合的方式对MMP活性有低选择性抑制。结果表明，人真皮干细胞条件培养液能降低衰老成纤维细胞MMP1表达，并上调TIMP1[30]。在此基础上，进一步的体外实验表明，干细胞外泌体不仅降低了自然衰老成纤维细胞中MMP的表达，而且对UVB诱导的成纤维细胞MMP1、MMP3过表达也有明显的抑制作用[9,20]。间充质干细胞来源于脂肪来源的间充质细胞(ADSCs)，可显著降低角膜基质细胞MMP1,MMP2,MMP3,MMP9的分泌水平，并提高与细胞外基质有关的4种胶原蛋白，包括Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ型胶原蛋白，纤维连接蛋白[31]。但另一项研究发现，ADSCs源外泌体通过Erk/MAPK信号通路活化外泌体MMP3，并随着MMP3的浓度增加而愈多[32]，使过度增生的纤维降解，从而达到无瘢痕愈合。说明外泌体对MMP的调节是双向的。由于修复机制的不完善，细胞外基质合成与降解的长期不平衡，弹力纤维和胶原纤维的损伤加速了真皮结构的破坏，这是真皮老化的分子特征。

外泌体对ROS的作用及其分子生物学机制。

其主要成分为过氧化氢、超氧化物阴离子、羟基等，是细胞代谢的产物。ROS在细胞增殖、分化过程中参与细胞信号传导，对机体有益；ROS在高浓度时可引起DNA、蛋白质和脂类氧化应激损伤。UV辐射能产生大量ROS，而ROS对真皮成纤维细胞的功能有影响，可诱导MMP的合成，对胶原蛋白、弹力蛋白等细胞外基质成分有损伤，ROS参与的氧化还原反应信号途径调控异常，也与衰老有关[13,33]。老化的成纤维细胞比正常细胞产生的ROS更多[13,34-35]。人类皮肤干细胞(humandermalstem/progenitorcell,hDSPCs)的条件培养基通过提高超氧化物歧化酶2(superoxidedismutases,SOD2)以降低ROS水平[30]。MDA反映了脂质过氧化反应对细胞毒性的损害程度。通过旁分泌机制，ADSCs升高SOD，降低MDA水平，逆转半乳糖诱导的皮肤氧化应激反应[36]。GSH过氧化物酶(glutathioneperoxidase1,GPX1)是清除ROS的主要酶系，同时NOX也被称为原型辅酶Ⅱ(nicotinamideadeninedinucleotidephosphate,NADPH)氧化酶，它是在体内生成ROS的关键酶系，研究发现ADSCs来源的外泌体能够抑制NOX1,NOX2的表达，从而减少ROS的生成[37]；在有关NOX1,NOX4,NOX1,NOX4,NOX4,NOX4,NOX4,NOX4,NOXS的产生[38]。通过转运GPX1，脐带间充质干细胞来源的外泌体可以降低肝细胞ROS水平[39]。通过体内富含miR-214的靶向沉默钙调蛋白依赖蛋白激酶Ⅱ(CaM-dependentproteinkinaseⅡ，CaMKⅡ)的表达，外泌体能够抑制ROS，防止心肌细胞氧化应激损伤[40]。最近的研究发现，外泌体通过运输NOX2到神经轴突中调节ROS的产生，从而促进轴突再生[41]。ROS的生成、清除过程中，干细胞外泌体具有一定的功能，其具体机制值得进一步研究。

总结与展望。

总之，干细胞外泌体通过激活多种信号途径参与调节成纤维细胞增殖能力，恢复细胞外基质成分，降低ROS，从而逆转皮肤老化，为抗衰老治疗带来新的希望。但是，目前还不清楚外泌体是否可以完全替代模拟干细胞的功能，也不清楚外泌体治疗的远期风险，还不清楚外泌体的分离纯化是否可以进一步提高，未来是否可以生产出含有特定内容物的外泌体进行精确治疗，这些都是值得我们进一步探索的方向。